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盐水法、微板法和微柱凝胶法检测O型血清中抗-A,抗-B效价的比较研究
2014-04-23 17:42:08 来源:我的网站 浏览:987

陈民才1  贾帅争2  席映辉3  冯双利3  王全立1
(1.解放军总医院输血科 100853  2. 军事医学科学院野战输血研究所3. 廊坊市血液中心)
 
摘要:目的 比较用盐水法、微板法和微柱凝胶法检测O型血清抗-A,抗-B效价的可靠性及可操作性,选择一种检测大批量标本的可靠方法。方法 使用盐水法、微板法和微柱凝胶法对同一组30例标本进行检测和比较。 结果 三种方法检测结果没有一致性,盐水法敏感性最低,微柱凝胶法敏感性最高。微板法的检测结果较为稳定。结论 微板法适合进行大批量标本的抗体效价检测。
Abstract: Objective To compare the reliability、economical and accurately of the three methods, Physiological Saline Solution medium Technique(PSST),Microplate Technique(MPT), Microclumn Technique(MCT)to testing antibody titers of O type blood serum, choose a best way to test samples in scores. Methods we tested the same group of samples using the three ways. Results there is no coherence between the three methods, PSST has the lowest sensitivity and cost, MCT   is the reverse.. MPT has a better stabilization and lower cost. Conclusion: MPT  is suit to test  a great lot of samples’ antibody titers.
    O型血在战时和紧急条件下可以不经过交叉配血直接给患者输注,很少引起输血反应[1、2],但是含有高效价(>1:64)抗A(B)抗体的O型血可以引起严重的输血反应[3]。国外把经过筛查的低效价O型血作为通用血使用。为了研究中国人O型 血人群中血清中抗体效价的水平,寻找一种快速,经济,准确的检测抗体效价的方法,我们使用盐水法、微板法和微柱凝胶法对同一组标本进行了检测。
1.        材料与方法
1.1   O型血清  随机从检测合格的献血者中抽取30份标本,分离血清。 取400ul血清从1:2开始做倍比稀释直至1:512。另外取400ul加入等量的0.1M/LDTT放置于37℃水温箱中破坏IgM。1小时后取400ul从1:2开始做倍比稀释直至1:512。
1.2   微板的准备 a 制备红细胞 用生理盐水洗涤A型和B型红细胞3次,再用PH7.3的磷酸盐缓冲液洗一遍,然后配成1%的红细胞悬液。b固定红细胞 在U型板中加入上述1%的筛选红细胞悬液,每孔50μl,置离心机中400转离心2分钟,使红细胞平铺孔底。
1.3   红细胞的制备 选取5人份的A型及B型红细胞分别混合,用生理盐水洗涤3次,稀释成2%的红细胞悬液。
1.4   指示细胞的制备:洗涤后的三人份O型红细胞,1:1的加入抗-D(IgG)血清,37℃孵育15分钟,用生理盐水洗涤5次,最后一次用PH7.3的磷酸盐缓冲液洗涤,再用含糖的磷酸盐缓冲液配成1%的细胞悬液。
1.5   微柱凝胶法机器的准备:使用Diana半自动配血仪,先将机器预热,离心微柱凝胶卡。
1.6   分别使用试管法、微板法,微柱凝胶法检测同一份标本的IgM、IgG抗-A,抗-B效价。
2.        实验步骤
2.1 盐水法IgM的检测 取上述倍比稀释后的O型血清100ul,分别与2%的A及B型红细胞50ul反应,离心后读取IgM抗-A,抗-B效价。
2.2 盐水法IgG的检测  取上述破坏了IgM的倍比稀释后的O型血清100ul,分别与2%的A及B型红细胞50ul在37℃水浴箱中孵育1小时,然后取出用盐水离心法洗涤3次,倾去上清液,加入抗人球蛋白1滴,混匀5分钟后读取结果。
2.3微板法IgM的检测  取U形板,在标记好顺序的微孔内分别加入上述倍比稀释后的O型血清50ul,分别与2%的A及B型红细胞25ul反应,离心后读取IgM抗-A,抗-B效价。
2.4 微板法IgG的检测  取上述制备好的U形板,每孔加入被检O型血清100μl,37℃孵育30分钟,弃去孔内溶液,用生理盐水洗4遍,每孔加入抗人球蛋白试剂50μl,再加入指示细胞50μl, 3000转离心1分钟,读取结果,孔内红细胞呈扣状沉淀为阴性,平铺于孔底为阳性。
2.5 微柱凝胶法IgM的检测 取倍比稀释后的O型血清置于配血仪的相应位置,启动检测程序,使用nature卡进行检测,加样后使用专用离心机进行离心,结果判读仪读取结果。
2.6微柱凝胶法IgG的检测 取倍比稀释后的O型标本置于配血仪的相应孔内,启动检测程序,使用coombs卡进行检测,加样孵育15分钟后使用专用离心机进行离心,结果判读仪读取结果。
3.统计方法:计量资料的秩和检验,组间比较采用参数检验
4.结果:
       表1.盐水法、微板法和微柱凝胶法检测O型血清抗-A,抗-B效价的比较
 
IgM-A
IgM-B
IgG-A
    IgG-B
微板法
13.00±1.49
11.06±1.42
38.42±2.08
39.40±2.08
盐水法
18.81±1.61
15.63±1.59
12.41±1.52
22.63±1.87
微柱凝胶法
11.85±1.48
18.38±1.42
124.5±1.75
114.56±2.38

三种方法检测结果比较均没有一致性,差异显著,p〈0.05。检测IgM-A微板法与微柱凝胶法比较结果差异不明显 p〉0.05。在IgM-B、IgG-A、IgG-B的结果比较上,三者之间的差异均十分显著,p〈0.01。
表2.三种方法检测所需要时间的比较(h)
表                  IgM                   IgG
试管法            1.75                  4.5
微板法            0.7                   2.2
微柱凝胶法        2.7                   4.0

  三种方法检测所需要时间的统计检验差异显著,三者之间没有一致性。
 
表3.三种方法成本比较(元/份标本)
               所需金额
试管法         10~15
微板法         10~15
微柱凝胶法     100~140
 
5.讨论
IgM引起血管内溶血反应,IgG引起血管外溶血。IgM能迅速活化补体,与红细胞上的抗原结合后,其FC段与补体的结合点暴露,结合C1q分子,启动补体的经典激活途径,最后导致红细胞肿胀并破裂。红细胞在血管内溶血,将血红蛋白释放到血浆中,当血红蛋白超过珠蛋白结合力时就从尿中排泄,同时导致间接胆红素升高,血中游离血红蛋白升高,LDH升高,正铁蛋白升高,血红素结合蛋白下降,临床上可表现出急性溶血性输血反应,如发热、寒战、面红、腰痛、解酱油色小便等,进而会出现尿少,尿闭等急性肾功能衰竭表现,可引发系统性高血压症,肾脏血管紧缩及肾血管的血栓形成,红细胞的破坏还可激活神经内分泌系统、凝血系统,可产生休克和DIC,甚至死亡。由此可见,O型血液异型输注后如果抗体效价过高会引起十分严重的不良后果,输血前的抗体效价检测也就十分重要和必要了。
抗体效价测定是一种半定量的方法,不同时间,不同实验室、不同的操作手法及检测方法和结果判读标准都会得出完全不同的结果,因此在实验操作中寻找一种稳定、客观、方便的方法就十分重要。目前国外许多国家都把低滴度O型红细胞当成通用血使用,在战伤救治和紧急输血条件下,首先输注O型红细胞,到有条件的中心以上级别医院后才输注型特异血液[4]。
通过实验,我们发现:在检测IgM的效价时,三种方法所得到的结果经过统计并没有一致性,但是都与以往的文献报道的结果相一致[5、6]。但是在检测IgG时三种方法的结果差异就十分显著了p<0.01,以微柱凝胶法检测的为最高,这主要是由于微柱凝胶法的特点决定的,微柱凝胶卡主要是利用分子筛的原理,红细胞与抗体结合后相互交联形成凝块,不能通过凝胶分子间隙,沉积在凝胶卡上层,通过自动读板仪读取结果,许多肉眼不可以见到的凝集都可以判读为阳性,血球洗涤不彻底,浓度过高或过低,离心不彻底以及血清中含有纤维蛋白凝块、细菌污染等都可以引起假阴性或假阳性的结果。作为最常使用的试管盐水检测法来讲,操作简单,成本低廉,但是操作复杂,结果读取因人而异,不适合大样本检测。微板法是近年新发展的一种方法[7],用其来检测抗原-抗体反应操作步骤少,速度快,结果的显示直观,可以同时处理大批量标本,并可以改进成为自动化加样、检测系统,用来进行抗体效价的检测发展潜力巨大。
 
6.结论
微板法用来进行大批量的o型血清中抗-A、抗-B抗体效价检定,结果稳定,经济快捷,并可以改良成为全自动检测方法,发展空间大,可以用在涉及到效价检测的很多方面。
 
 
参考文献:
1.      Barnes,A.transfusion of universal donor and uncross-matched blood. Bibl.Haematol[J], 1980,46:132-142
2.      Barnes,A.Status of the use of universal donor blood transfusion。 CRC Crit,Rev.Clin.Lab.Sci[J], 1973,4:147-160
3.      Josephson CD, Mullis NC, Van Demark C. Significant numbers of apheresis-derived group O platelet units have "high-titer" anti-A/A,B: implications for transfusion policy.  Transfusion[J].2004 Jun:44(6):802-804
4.      雷二庆 栾尧 单文戈.美军血液供应标准.解放军卫勤杂志[J].2003,1:54-56。
5.      关亮:O型人血清抗-A、抗B效价分析.中国输血杂志[J],2003 ,16(3): 189
6. 陈忠 徐秀玉 糜明珠等,140例O型供血者血清IgM抗A(B)和IgG抗A(B)效价的测定。中华血液学杂志[J],1980, 1(2):114-118
7. 刘小峰 杜国华 王静.微柱凝胶抗人球蛋白法在交叉配血中的应用。 现代检验医学杂志[J]2003, 18 (6):65-68

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